Transcription factor binding site

Transcription factor binding site是實驗能證明的區域，這段序列能與transcription factor 結合，進而開啟或關閉基因表現。本文沒有要強調Transcription factor binding site如何尋找或進行實驗驗證，僅介紹如何描述這段transcription factor binding site。

字串描述

最簡單的描述方法是CCATATATAG 這樣的單純字串描述，如下圖所示 （https://jaspar.genereg.net/sites/MA0001.1/）

String

這種顯示方式最直觀，也最好利用，大家可以想像只要使用Ctrl + F或grep等方式進行搜尋。

正規表示法描述

有些位置如果有超過一種以上的DNA出現，這時候單純用ATCGU表現就不太方便了。目前IUPAC有訂立一系列標準用字去描述這些可能性，請參考 https://en.m.wikipedia.org/wiki/Nucleic_acid_notation ，就像R代表purine，包含AG。而Y代表Pyrimidine，包含CT等等。

Position weight matrix (PWM)

其實，transcription factor binding site的專一性很少有達到需每一個base都正確才有效能。通常transcription factor binding site是由一堆可能性堆疊而成，它描述了每個位置出現的ATCG頻率。以下圖左邊為例，直的column 代表每個位置，而橫的row代表ATCG，所以矩陣裡面的數值就是每個位置 （column）裡，ATCG出現的頻率。以第一個位置而言，看起來C出現的頻率最高，但Q或G仍有出現之可能。

PMWDNAlogo
PMW exampleDNAlogo

Ref. https://jaspar.genereg.net/matrix/MA0001.1/?revcomp=1

通常這種描述太數學了，如果想更視覺化一點，我們會把這些序列轉成DNAlogo的型態來描述，如上圖右側所示，因為第一個位置C出現的機率遠大約於其他核酸，所以就會看到一根很大的C。

好，那position weighted matrix看起來最實際，但該怎樣用它來搜尋全基因體，或是promoter region呢？

MEME package FIMO找序列

簡單暴力解，MEME package 裡面的FIMO專做這件事情 (https://meme-suite.org/meme/tools/fimo)，只要有PWM，並改成MEME家的格式，餵給FIMO，再給一段序列，FIMO就能幫忙尋找這段PWM是否存在給定序列裡了。

這樣有簡單的輸出結果可以參考 https://meme-suite.org/meme/doc/examples/fimo_example_output_files/fimo.html 。MEME package 最貼心的是，他會在最下面列出現在使用的指令是什麼，你可以使用這指令在自己的電腦上重現這些結果

# Command line:
Fimo –oc fimo_example_output_files –parse-genomic-coord some_vertebrates.meme mm9_tss_500bp_sampled_1000.fna

# Settings:
Output_directory = fimo_example_output_files	
MEME file name = some_vertebrates.meme	sequence file name = mm9_tss_500bp_sampled_1000.fna
Background file name = --nrdb--	
alphabet = DNA	
max stored scores = 100000
Allow clobber = true	
compute q-values = true	parse genomic coord. = true
Text only = false	
scan both strands = true	max strand = false
Threshold type = p-value	
output theshold = 0.0001	
pseudocount = 0.1
Alpha = 1	verbosity = 2

MEME package MEME建立PWM

那如何建立PMW呢？最棒的方法是用multiple sequence alignment，真實的看到了某堆序列裡，真的有一段conserved sequence (高度保留序列)，我們再拿這個高度保留序列製成PMW。但這挑戰性極高，DNA multiple sequence alignment 沒那麼好做，所以簡單做法是透過生物實驗，像是RNA sequence找出coexpression network，或是用kmean把具有一致expression patterns 的基因們打撈出來，甚至做chip seq，直接測量蛋白質與DNA的結合。最後再拿這些資料給MEME，讓他幫忙找在這些序列裡是不是真的藏有一些短片段。

注意：MEME定義的PMW motif有兩大前提假設，第一是gapless，也就是禁止出現gap。第二，長度要一致。也就是說MEME如果發現兩個長度不一致的motif，它會直接定義成兩個motif

實際範例：https://meme-suite.org/meme/doc/examples/meme_example_output_files/meme.html?man_type=web

meme lex0.fna -oc meme_example_output_files -dna -mod zoops -nmotifs 3 -revcomp -mpi

背後原理

MEME背後是進行EM (Expectation-Maximization Algorithm)。實際範例可以參考 RNA motif discovery: a computational overview | Biology Direct | Full Text (biomedcentral.com)。下圖A是一個典型的PMW，而圖B是實際應用。X代表序列，而Z代表有沒有搜尋到motif，0代表沒有，1代表有，且紅色的序列就代表了motif。由於第一個位置與許A與G的機率很高，所以可以看到A、G都能當成第一個序列

EM algorism